La esclerosis lateral amiotrófica (ELA), comúnmente conocida como enfermedad de Lou Gehrig y enfermedad de Stephen Hawking, es una enfermedad neurodegenerativa que provoca la pérdida gradual del control de los músculos del cuerpo. Actualmente es incurable y se desconoce la causa de la enfermedad en más del 90% de todos los casos, aunque se cree que están involucrados tanto factores genéticos como ambientales.
Los grupos de investigación del Dr. Akira Kitamura de la Facultad de Ciencias de la Vida Avanzadas de la Universidad de Hokkaido y el Prof. Jerker Widengren del KTH Royal Institute of Technology de Suecia han desarrollado una técnica novedosa que puede detectar una estructura característica del ARN en tiempo real en células vivas. La técnica, que se basa en la espectroscopia microscópica de fluorescencia, se publicó en la revista Investigación de ácidos nucleicos.
«Uno de los factores genéticos que se cree que está involucrado en el desarrollo de la ELA es una secuencia específica de ARN que forma una estructura de cuatro cadenas, llamada G-quadruplex», explica Kitamura, primer autor del estudio. «Normalmente, estas estructuras regulan la expresión de los genes. Sin embargo, una mutación en el cromosoma 9 en humanos da como resultado la formación de cuádruplex G que pueden desempeñar un papel en las enfermedades neurodegenerativas, incluida la ELA».
Uno de los mayores obstáculos para comprender el papel exacto de los cuádruplex G en la enfermedad han sido las limitaciones para estudiar su formación y ubicación dentro de las células vivas en tiempo real. Los grupos de Kitamura y Widengren lograron desarrollar una técnica simple, robusta y ampliamente aplicable que resuelve los problemas existentes.
La técnica rastrea un tinte de cianina llamado Alexa Fluor 647 (AF647). Cuando se etiqueta con ARN, el estado de parpadeo de fluorescencia del tinte se altera con la formación de cuádruplex G de ARN. Los grupos analizaron el ARN marcado con AF647 utilizando una técnica de microscopía llamada monitoreo TRAST (TRAnsient STate) para detectar este parpadeo de fluorescencia en tiempo real.
«Visualmente, los cambios en la intensidad de la fluorescencia resueltos en el tiempo aparecen como parpadeantes», dijo Kitamura, describiendo la técnica. «En TRAST, exponemos las células a un patrón específico de intensidades de luz cambiantes y medimos la intensidad promedio de la fluorescencia emitida por el colorante unido al ARN en las células a lo largo de intervalos de tiempo específicos. Al medir los cambios en las propiedades de parpadeo, podemos distinguir las estructuras de ARN dentro de la célula».
El equipo calibró su experimento en condiciones de laboratorio, determinando exactamente qué parpadeo de fluorescencia correspondía a cuádruplex de ARN G. A partir de estos datos, pudieron determinar la ubicación de los cuádruplex G de ARN dentro de las células vivas utilizando TRAST.
Este trabajo demuestra que los tintes de cianina pueden proporcionar parámetros de lectura sensibles sobre los estados de plegamiento de los cuádruplex G de ARN en células vivas, e incluso para células individuales. Esto, a su vez, permite la posibilidad de estudiar los RNA G-quadruplex en enfermedad en tiempo real a nivel intracelular. También se puede aplicar para estudiar el plegamiento y el mal plegamiento de proteínas en las células.
