Un nuevo avance supera las limitaciones actuales en transcriptómica espacial con un método basado en nanotecnología de ADN llamado ‘Light-Seq’. Light-Seq permite a los investigadores ‘geoetiquetar’ el repertorio completo de secuencias de ARN con códigos de barras de ADN exclusivos para unas pocas células de interés. Estas células objetivo se seleccionan usando luz bajo un microscopio a través de un proceso de fotorreticulación rápido y efectivo, y sus ARN se ponen a disposición para la secuenciación de próxima generación con la ayuda de una nueva técnica impulsada por nanotecnología de ADN. Todo este proceso se puede repetir para diferentes poblaciones de células en la misma muestra.
Bajo el microscopio, los investigadores a menudo observan diferentes tipos de células organizándose en patrones peculiares dentro de los tejidos o, a veces, un tipo de célula raro que se destaca al ocupar una posición única, exhibir una forma inusual o expresar una molécula biomarcadora específica. Para determinar el significado más profundo de sus observaciones, han desarrollado enfoques para acceder también a los patrones de expresión génica de las células (transcriptomas) mediante el análisis de las moléculas de ARN derivadas de genes presentes en ellas, que pueden relacionar con las formas, las posiciones espaciales y las características moleculares de las células. biomarcadores.
Sin embargo, estos enfoques de «transcriptómica espacial» solo capturan una fracción de las moléculas de ARN totales de una célula y no pueden ofrecer la profundidad y calidad de análisis que brindan los métodos de secuenciación de una sola célula, que se desarrollaron para investigar los transcriptomas de células individuales aisladas de tejidos. o biofluidos a través de Técnicas de secuenciación de próxima generación (NGS). Tampoco permiten que los investigadores se centren únicamente en células específicas en función de su ubicación en un tejido, lo que facilitaría en gran medida la búsqueda de poblaciones de células inconexas, o células raras y difíciles de aislar, como células cerebrales raras con funciones únicas, o células inmunitarias. células que invaden los tumores. Además, debido a que se altera el entorno del tejido original, muchas transcriptómicas espaciales y todos los métodos de secuenciación unicelular impiden que los investigadores revisen sus muestras para realizar análisis de seguimiento, y son costosos porque requieren instrumentos o reactivos especializados.
Un nuevo avance realizado en el Instituto Wyss de Ingeniería Biológicamente Inspirada en la Universidad de Harvard ahora supera estas limitaciones con un método impulsado por nanotecnología de ADN llamado «Light-Seq». Light-Seq permite a los investigadores «geoetiquetar» el repertorio completo de secuencias de ARN con códigos de barras de ADN exclusivos para unas pocas células de interés. Estas células objetivo se seleccionan usando luz bajo un microscopio. a través de un proceso de fotorreticulación rápido y eficaz.
Con la ayuda de una nueva nanotecnología de ADN, las secuencias de ARN con código de barras se traducen luego en hebras de ADN coherentes, que luego se pueden recolectar de la muestra de tejido e identificar mediante NGS. El proceso Light-Seq se puede repetir con diferentes códigos de barras para diferentes poblaciones de células dentro de la misma muestra, que se deja intacta para el análisis de seguimiento. Con un rendimiento comparable a los métodos de secuenciación de una sola célula, amplía significativamente la profundidad y el alcance de las investigaciones posibles en una muestra de tejido. El método está publicado en Métodos de la naturaleza[BB1] .
«La combinación única de características de Light-Seq satisface una necesidad insatisfecha: la capacidad de realizar análisis de secuenciación profunda, espacialmente prescritos e informados por imágenes de poblaciones de células difíciles, si no imposibles de aislar, o tipos de células raras en tejidos preservados, con una -a-uno de su estado de expresión génica altamente refinado con características espaciales, morfológicas y potencialmente relevantes para la enfermedad», dijo Peng Yin, Ph.D., uno de los cuatro autores correspondientes y miembro de la facultad principal en el Instituto Wyss, donde su grupo desarrolló Light-Seq. «Por lo tanto, tiene potencial para acelerar el proceso de descubrimiento biológico en varias áreas de investigación biomédica». Yin también es profesor de Biología de Sistemas en la Facultad de Medicina de Harvard (HMS).
Desde el código de barras en el lugar a la secuenciación ex situ
El proyecto Light-Seq fue encabezado por Jocelyn (Josie) Kishi, Ph.D., Sinem Saka, Ph.D., y Ninning Liu, Ph.D. en el grupo de Yin en Wyss, y Emma West, Ph.D. en el laboratorio de Constance Cepko en el HMS. Anteriormente, Kishi y Saka habían desarrollado SABER-FISH como un método de transcriptómica espacial para obtener imágenes de la expresión génica directamente en tejidos intactos (en el lugar). «Con SABER-FISH, todavía estábamos a órdenes de magnitud de capturar los programas completos de expresión génica de las células, con muchos miles de moléculas de ARN diferentes por célula. Las moléculas de ARN están demasiado empaquetadas para ser capturadas en su totalidad usando las técnicas de imagen actuales, » dijo el co-primer y co-autor correspondiente Kishi. «Light-Seq resuelve este problema al combinar el etiquetado de códigos de barras de alta resolución con la secuenciación del transcriptoma completo a través de NGS, lo que nos brinda lo mejor de ambos mundos y ventajas clave adicionales». En el momento del estudio, Kishi era becaria de desarrollo tecnológico de Wyss en el equipo de Yin y ahora está siguiendo el camino hacia la comercialización de Light-Seq junto con algunos de sus coautores.
«Para secuenciar específicamente las células en ubicaciones seleccionadas a medida de muestras de tejido intacto, desarrollamos un nuevo enfoque para fotorreticular códigos de barras de ADN con copias de moléculas de ARN, y un procedimiento impulsado por nanotecnología de ADN que los hace legibles por NGS, junto con sus secuencias de ARN adjuntas. «, dijo el coautor Liu, becario postdoctoral en el grupo de Yin, quien previamente co-desarrolló una plataforma de código de barras de ADN paralelizado para un método de imágenes de súper resolución llamado «Action-PAINT» que también se convirtió en uno de los componentes centrales de Light-Seq.
Primero, los cebadores de ADN forman «pares de bases» con moléculas de ARN en las células y se extienden para crear copias de las secuencias de ARN llamadas secuencias de ADN complementarias (ADNc). Luego, las hebras de código de barras de ADN que contienen un nucleótido fotorreticulante ultrarrápido se emparejan a su vez con las bases de los ADNc en las células. Estos se unen de forma permanente cuando una célula objetivo se ilumina bajo el microscopio a través de un dispositivo óptico similar a una plantilla que mantiene en la oscuridad a otras células que no son objetivo en el campo microscópico y, por lo tanto, las protege de la reacción de fotorreticulación. Después de lavar las secuencias de ADN con código de barras de las células que no estaban unidas permanentemente en el lugarel procedimiento se puede repetir con diferentes códigos de barras y patrones de luz para etiquetar más regiones de interés.
«Para poder integrar este flujo de trabajo de códigos de barras con NGS, diseñamos una nueva reacción de costura basada en nanotecnología de ADN. Esta innovación nos permite convertir nuestros ADNc con código de barras en secuencias de lectura contiguas. Luego podemos extraer la colección completa de códigos de barras que contienen secuencias de ADNc de la muestra y analizarlas con técnicas estándar de NGS», explicó Saka, uno de los autores correspondientes del estudio que actualmente es líder de grupo en el Laboratorio Europeo de Biología Molecular en Heidelberg, Alemania. «En última instancia, cada código de barras rastrea la lectura completa del transcriptoma hasta las células preseleccionadas en la muestra de tejido, que permanece intacta para análisis posteriores. Esto nos brinda la oportunidad única de volver a visitar exactamente las mismas células después de la secuenciación para validación o exploración adicional».
Mirando tejidos complejos y células raras
Tras la primera validación de Light-Seq en células cultivadas, el equipo de Yin quería aplicarlo a un tejido complejo y se asoció con el grupo de Constance Cepko, Ph.D. en HMS. Cepko es uno de los autores correspondientes del estudio y Profesor Bullard de Genética y Neurociencia en el Instituto Blavatnik del HMS, e investiga el desarrollo de la retina como modelo del sistema nervioso. Kishi, Saka y Liu unieron fuerzas con West en el grupo de Cepko para aplicar Light-Seq a secciones transversales de la retina del ratón y perfilar tres capas principales con diferentes funciones. Los investigadores alcanzaron una cobertura de secuencia comparable a los métodos de secuenciación de una sola célula y descubrieron que miles de ARN estaban enriquecidos entre las tres capas principales de la retina. También demostraron que después de la extracción de la secuencia, las muestras de tejido permanecieron intactas y se pudieron obtener más imágenes de proteínas y otras biomoléculas.
«Llevando Light-Seq al extremo, pudimos aislar el transcriptoma completo de un tipo de célula muy raro, conocido como ‘células amacrinas dopaminérgicas’ (DAC), que es extremadamente difícil de aislar debido a sus intrincadas conexiones con otras células en la retina, recuperando solo de cuatro a ocho células codificadas individualmente por sección transversal», dijo West. Los DAC participan en la regulación del ritmo circadiano del ojo ajustando la percepción visual a diferentes exposiciones a la luz durante el ciclo día-noche. «Light-Seq también detectó ARN que se expresaron específicamente en DAC en niveles bajos, así como docenas de ARN de biomarcadores específicos de DAC que, hasta donde sabemos, no se habían descrito antes, lo que abre nuevas oportunidades para estudiar este tipo de célula poco común. «, agregó West, quien en el momento del estudio era estudiante de posgrado y luego becario postdoctoral con Cepko, y ahora se unió a Kishi en su esfuerzo de comercialización de Light-Seq.
Abrir el campo de la transcriptómica espacial hasta NGS también agrega información sobre el nivel de una sola especie de ARN. «Nuestros datos de secuenciación mostraron claramente que Light-Seq puede determinar variaciones naturales en la estructura de los ARN. En el futuro, estamos muy interesados en usar Light-Seq para comprender mejor la interacción entre el sistema inmunitario, las células que propagan enfermedades y diferentes estrategias terapéuticas como la terapia génica y celular», dijo Kishi.
«La tecnología Light-Seq desarrollada en el grupo de Peng Yin en la Iniciativa de Robótica Molecular del Instituto Wyss muestra una vez más cómo seguir un enfoque totalmente poco convencional y aprovechar la biología sintética puede conducir a una tecnología disruptiva con un gran potencial para avanzar tanto en la investigación fundamental como en la medicina clínica». dijo el director fundador de Wyss, Donald Ingber, MD, Ph.D., quien también es el Judah Folkman Profesor de Biología Vascular en la Escuela de Medicina de Harvard y el Hospital de Niños de Boston, y el Hansjörg Wyss Profesor de Ingeniería Bioinspirada en la Escuela de Ingeniería y Ciencias Aplicadas John A. Paulson de Harvard.
Otros autores del estudio son los miembros del laboratorio Yin Kuanwei Sheng, Jack Jordanides y Matthew Serrata. Fue financiado por el Instituto Wyss a través de su Programa de Proyecto de Validación y una Beca de Desarrollo de Tecnología para Kishi, subvenciones de la Oficina de Investigación Naval (subvención n.° N00014-18-1-2549) y los Institutos Nacionales de Salud (subvención n.° 2019-02433). ), así como el apoyo del Laboratorio Europeo de Biología Molecular y el Instituto Médico Howard Hughes.
