Investigadores inventan trampa para capturar y comparar células bacterianas individuales

Todos los hospitales luchan contra una amenaza invisible: Pseudomonas aeruginosa. Es un tipo de bacteria que afecta a miles de pacientes cada año en unidades de cuidados intensivos, donde puede causar sepsis, neumonía y otro tipo de infecciones.

«Para la persona sana promedio, P. aeruginosa no representa una amenaza grave», dijo el bacteriólogo Joshua Shrout de la Universidad de Notre Dame. «Pero para aquellos que son más vulnerables, que están inmunocomprometidos, que usan un ventilador o un catéter, o que se están recuperando de quemaduras o cirugías graves, no solo es grave, sino que pone en peligro la vida. Y eso se debe a la sofisticada bacteria». conjunto de tácticas de autodefensa».

Shrout, profesor en el Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental y Ciencias de la Tierra, dirige un grupo de investigación que estudia esas tácticas en intrincado detalle. Él explica que además de ser resistente a muchos de los antibióticos más comunes, P. aeruginosa se adhiere fácilmente a las superficies donde crea su propia protección al cubrirse con una biopelícula similar a un polímero. Bajo ciertas condiciones, P. aeruginosa también puede adquirir cepas de antibióticos de otros organismos, e incluso puede generar cianuro para matar a los competidores.

Pensando fuera de la placa de Petri

Hace una década, Shrout comenzó a colaborar con Paul Bohn, profesor Arthur J. Schmitt de Ingeniería Química y Biomolecular y director del Instituto Berthiaume para la Salud de Precisión de Notre Dame. El laboratorio de Bohn se especializa en crear nuevas tecnologías para un análisis más preciso de células y moléculas. Juntos, Bohn y Shrout comenzaron a buscar nuevas formas de observar microorganismos como P. aeruginosa, yendo más allá del proceso tradicional de observar cultivos celulares cultivados en una placa de Petri.

«Si cultivas y observas un cultivo completo de células, estás viendo comportamientos generales, en promedio», dijo Bohn. «Pero ahora sabemos que los mayores efectos a veces provienen de la minoría de una población determinada».

Shrout explicó este efecto usando una analogía con los comportamientos de otros organismos. «Imagina que estás sentado en tu porche trasero escuchando a los grillos afuera», dijo. «Puede haber miles de grillos, pero los que te afectan son los que cantan. También puede haber tipos similares de variación en las poblaciones de bacterias. Sin embargo, la mayoría de los microbiólogos no tienen las herramientas para apreciar completamente los efectos de los grillos menores». jugadores dentro de una población».

Bohn y Shrout sabían que antes de poder encontrar las diferencias clave en una población de P. aeruginosa, tendrían que resolver algunos desafíos técnicos importantes. Primero, necesitarían capturar células individuales. Luego, para realizar un experimento significativo, necesitarían aplicar el mismo estímulo a las células de la misma manera al mismo tiempo. Y, finalmente, necesitarían una forma de observar el experimento, rastreando las diferencias entre las células a medida que responden al estímulo.

Con fondos del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas y la Fundación Nacional de Ciencias, Bohn y Shrout decidieron ser pioneros en un nuevo enfoque. «Al principio», dijo Bohn, «nos cautivó una pregunta muy simple: ‘¿Qué pasa si taladramos agujeros del mismo diámetro que las células bacterianas? Si lo hacemos, ¿podríamos inducir a las células a moverse y permanecer adentro?’ »

Construyendo una mejor trampa para bacterias

Allison Cutri, estudiante de doctorado en química en el grupo de investigación de Bohn, asumió el desafío de crear el dispositivo como parte de su investigación de tesis. Cutri trabajó junto con el investigador asociado postdoctoral Vignesh Sundaresan para desarrollar la plataforma principal del dispositivo dentro de la sala limpia en las instalaciones de nanofabricación de Notre Dame. Usaron un proceso aditivo, construyendo la plataforma capa por capa como un microchip. Para el núcleo del dispositivo, usaron una capa de epoxi y cubrieron ambos lados con una fina capa de oro para conducir la electricidad a los puntos específicos de cada bacteria, como si se colocara un electrodo en cada extremo de la celda.

Luego, Cutri trabajó con la Instalación de imágenes integradas de Notre Dame para fresar más de 100 pequeños agujeros llamados microporos en el dispositivo. Cada microporo se perfora con un haz de iones enfocado a un diámetro de menos de una micra, o unas 50 veces más pequeño que el diámetro de un cabello humano, para permitir que una bacteria se deslice hacia el interior.

Gracias a la propensión de P. aeruginosa a adherirse a las superficies, Cutri pudo acorralar células individuales en el dispositivo y en los microporos, donde cada una se instaló en su propio poro. Luego, el equipo pudo aplicar cargas eléctricas a través de las capas de oro mientras filmaba el experimento a través de un microscopio de fluorescencia especialmente diseñado para observar una clase de moléculas bacterianas.

Observaron el resplandor de los pozos, lo que demostró que el dispositivo se había cargado correctamente con bacterias. Y mientras probaban regimiento tras regimiento de células, notaron que comenzaban a surgir patrones. Algunas células brillaron junto con la carga eléctrica. Otros brillaron intermitentemente en respuesta a la carga, mientras que un tercer grupo brilló independientemente de la carga.

«Todavía no estamos seguros de qué otras diferencias podrían existir o qué significan las diferencias para combatir la P. aeruginosa», dijo Shrout. Sin embargo, tras una investigación más profunda, pudieron ver patrones similares en un tipo diferente de bacteria: E. coli. También pudieron determinar que el estado metabólico de cada célula, ya sea que absorbiera o gastara energía, desempeñaba un papel clave en la configuración de su comportamiento.

Por ahora, los investigadores dijeron que tienen la esperanza de que los patrones que observaron y el dispositivo que crearon, que se describieron recientemente en Informes celulares Ciencias físicasinspirará proyectos de investigación similares.

«Hace tiempo que sabemos que P. aeruginosa exhibe un comportamiento fluorescente en respuesta a una carga», explicó Cutri. «Pero para reconocer que hay tanta variación en la forma en que responden las células, se necesita un dispositivo que le permita observar las células individualmente. Con los enfoques existentes, esas diferencias estarían enmascaradas».

Shrout agregó: «Como investigador, es gratificante no solo hacer nuevas preguntas, sino también desarrollar nuevas herramientas y nuevas plataformas que hagan posibles esas preguntas. Al reunir el conocimiento del comportamiento celular con la nanofabricación y las imágenes de alta resolución , eso es lo que hemos podido hacer con este proyecto”.