Los científicos que estudian una enzima del coronavirus COVID-19 a temperaturas que van desde heladas hasta las cálidas del cuerpo humano descubrieron cambios estructurales sutiles que ofrecen pistas sobre cómo funciona la enzima. Los hallazgos, publicados en IUCrJla revista de la Unión Internacional de Cristalografía, puede inspirar el diseño de nuevos medicamentos para contrarrestar el COVID-19 y posiblemente ayudar a prevenir futuras pandemias de coronavirus.
«Ningún estudio anterior ha analizado esta importante enzima del coronavirus a temperatura fisiológica (o corporal)», dijo Daniel Keedy, biólogo estructural de la Universidad de la Ciudad de Nueva York (CUNY), quien realizó el estudio en colaboración con científicos del Departamento de Estado de EE. UU. del Laboratorio Nacional Brookhaven de Energía.
La mayoría de las estructuras hasta la fecha provienen de muestras congeladas, lejos de las temperaturas a las que operan las moléculas dentro de las células vivas. «Si está trabajando a temperatura fisiológica, debería obtener una imagen más realista de lo que sucede durante una infección real, porque ahí es donde ocurre la biología», dijo Keedy.
Además, agregó, el equipo usó la temperatura como herramienta. «Al girar esa perilla y ver cómo reacciona la proteína, podemos aprender sobre su mecánica, cómo funciona físicamente.
Descifrando la estructura de Mpro
La proteína en cuestión es la proteasa principal (Mpro) del SARS-CoV-2, el virus que causa el COVID-19. Como todas las proteasas, es una enzima que corta otras proteínas. En muchas infecciones virales, incluida la COVID-19, las células infectadas producen inicialmente las proteínas funcionales de un virus como una sola cadena de proteínas conectada. Las proteasas cortan las piezas para que las proteínas individuales puedan fabricarse y ensamblarse en nuevas copias del virus. Encontrar un medicamento para desactivar Mpro podría frenar el COVID-19.
Para estudiar la estructura de la enzima, los investigadores utilizaron una técnica llamada cristalografía de rayos X en la fuente de luz de sincrotrón nacional II (NSLS-II) de Brookhaven Lab. NSLS-II es una instalación para usuarios de la Oficina de Ciencias del DOE que produce haces brillantes de rayos X. Hacer brillar esos rayos X en una muestra cristalizada de una molécula biológica puede revelar la disposición tridimensional de los átomos que componen la molécula.
Estudiar muestras que no están congeladas puede ser un desafío.
«Cuanto mayor sea la temperatura, mayores serán las posibilidades de que los rayos X dañen el cristal», explicó el coautor del estudio Babak Andi, que opera la línea de luz de cristalografía macromolecular fronteriza (FMX) de NSLS-II.
«Para minimizar el daño, giramos y movemos el cristal linealmente a medida que se mueve a través de los rayos X. Eso distribuye la dosis de rayos X en toda la longitud del cristal», dijo.
Señaló que el pequeño tamaño del haz de rayos X en NSLS-II hace posible mantener el haz enfocado incluso en la dimensión más pequeña del cristal, un borde que mide de 10 a 20 millonésimas de metro o menos, ya que gira
«Además, el detector FMX y otros sistemas funcionan tan rápido que podemos recopilar un conjunto de datos completo en solo 10-15 segundos por muestra, con una calidad lo suficientemente buena como para resolver una estructura antes de que ocurra un daño significativo por rayos X».
De congelado a fisiológico
Los científicos utilizaron FMX para recopilar la primera serie de datos cristalográficos Mpro a cinco temperaturas diferentes, que van desde criogénicas (-280 grados Fahrenheit) hasta lo que a menudo se denomina «temperatura ambiente» en cristalografía de rayos X (~39 °F ) a fisiológico (98°F). También estudiaron el cristal a temperatura ambiente bajo alta humedad. Luego introdujeron los datos en un tipo especial de simulación por computadora para identificar muchos posibles arreglos a nivel atómico bajo cada conjunto de condiciones.
Los resultados revelaron cambios conformacionales sutiles, incluida una mayor flexibilidad en partes de la proteína a temperaturas más altas. El equipo también vio algunas características que eran exclusivas de la enzima en condiciones fisiológicas.
La mayoría de los cambios no estaban directamente en el «sitio activo» de la enzima, la parte que está directamente involucrada en cortar otras proteínas. En cambio, estaban en partes de la enzima más distantes de esa ubicación. Pero los datos sugieren que estos sitios distantes podrían afectar el sitio activo a través de una especie de mecanismo de control remoto que es común en los sistemas biológicos, dijo Keedy. Deshabilitar incluso esos lugares distantes podría potencialmente bloquear la función de la enzima.
«Puede pensar en Mpro como una especie de cinta doblada, compuesta por dos mitades idénticas (que forman dímeros) que se unen de manera simétrica, como un apretón de manos», dijo Keedy. El centro de esta región de apretón de manos (la «interfaz de dímero») se vincula con el sitio activo a través de una región de bucle flexible de la proteína.
Como explicó Keedy, los científicos descubrieron que a temperaturas más altas, «el agarre del ‘apretón de manos’ cambia: los dos componentes reajustan un poco su agarre. Esto nos dice que, cuando el virus nos infecta, puede haber algún tipo de de comunicación a través de este bucle entre la interfaz del dímero y el sitio activo», dijo Keedy.
El camino hacia el diseño de fármacos
«Vemos cambios sutiles en la estructura de este estudio, pero el diseño de fármacos depende de cambios sutiles: menos de una milmillonésima de metro aquí, menos de una milmillonésima de metro allá», anotó Keedy.
Otros estudios han demostrado que pequeñas moléculas parecidas a fármacos pueden se unen a la enzima en algunos de los lugares distantes identificados en este nuevo trabajo.
«Si pudiéramos perfeccionar estas moléculas, optimizarlas, elaborarlas, modificarlas, entonces podríamos tener un nuevo punto de apoyo para alterar la función de la enzima, no en el sitio activo, como esencialmente todos los antivirales para esta proteína». están apuntando actualmente, pero en un sitio diferente a través de un mecanismo diferente», dijo Keedy. «Nuestros hallazgos establecieron la inspiración para explorar esta idea».
El papel del agua
Explorar la enzima a una humedad elevada también imita las condiciones fisiológicas dentro de las células llenas de agua y puede proporcionar pistas adicionales para guiar el diseño de fármacos.
«Para estos estudios, después de seleccionar el cristal que queremos estudiar, le colocamos una funda especial para evitar que se seque», dijo Babak Andi de NSLS-II. «Luego, cuando colocamos la muestra en la línea de luz para la recopilación de datos de rayos X, retiramos la funda y soplamos una corriente continua de aire con una humedad del 99,5 % sobre el cristal mientras recopilamos los datos».
Los resultados revelaron moléculas de agua específicas que se unen libremente a la enzima, incluida una cerca del sitio activo, solo en condiciones de alta humedad.
«Esas moléculas de agua te dan una pista de dónde se pueden unir los inhibidores», dijo Andi.
Su grupo ha estado estudiando una variedad de posibles moléculas similares a fármacos que parecen reemplazar a las moléculas de agua débilmente unidas cuando se unen cerca del sitio activo de Mpro. Ese trabajo se informa en un artículo publicado recientemente en Informes científicos del portafolio de revistas de Nature.
Ambos científicos estaban agradecidos por el espíritu de colaboración de todo el equipo, que incluía científicos adicionales tanto en Brookhaven Lab como en CUNY, así como Diamond Light Source en el Reino Unido.
«Era muy importante poder tener la colaboración remota para hacer que este proyecto funcionara, donde teníamos personas en el sitio en la línea de luz y personas fuera del sitio que podían hacer el modelado por computadora», dijo Keedy. «Es un ejemplo de muchos durante la pandemia de la comunidad científica uniéndose».
Esta investigación fue apoyada por la Oficina de Ciencias del DOE a través del Laboratorio Nacional de Biotecnología Virtual (NVBL) con fondos de la Ley CARES de Coronavirus y con fondos del programa de Investigación y Desarrollo Dirigido por Laboratorio para la investigación de COVID-19 en Brookhaven Lab. La línea de luz FMX (17-ID-2) en NSLS-II está financiada por la Oficina de Ciencias (BES). Daniel Keedy cuenta con el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud (NIH, R35 GM133769). El Centro de Estructura BioMolecular (CBMS) en el NSLS-II de Brookhaven Lab, que incluye la línea de luz FMX, está financiado por los Institutos Nacionales de Salud, el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales y la Oficina de Ciencias del DOE (BER).
