Anteriormente, ha sido imposible capturar las imágenes de alta resolución de la nitrogenasa, la única enzima capaz de reducir el nitrógeno en amoníaco, durante la acción catalítica. Ahora, por primera vez, los investigadores de la Universidad de California en San Diego informan instantáneas de nitrogenasa de resolución casi atómica durante la catálisis utilizando microscopía electrónica criogénica (cryoEM). Los resultados fueron publicados en la revista Ciencias.
Este trabajo se logró a través de una estrecha colaboración entre los grupos del profesor Akif Tezcan y el profesor asistente Mark Herzik, ambos en el Departamento de Química y Bioquímica de UC San Diego. Si bien Tezcan ha estudiado durante mucho tiempo la nitrogenasa, Herzik proporcionó la experiencia en cryoEM necesaria para llevar a cabo la investigación.
“Este es un avance muy importante en términos de fijación biológica de nitrógeno y biología estructural en general”, afirmó Tezcan. «Poder obtener imágenes de resolución a nivel atómico de una enzima tan dinámica y compleja como la nitrogenasa en acción es extremadamente emocionante. Abre las puertas para comprender completamente el mecanismo de esta enigmática enzima, que ha preocupado a los investigadores durante décadas».
Comprender la importancia de estas imágenes cryoEM requiere comprender la tremenda importancia global de la fijación de nitrógeno. Todos los organismos requieren fuentes «fijas» de nitrógeno para la biosíntesis de los componentes básicos de la vida, como las proteínas y el ADN. Sin embargo, la mayoría de los organismos vivos no poseen la enzima nitrogenasa y no pueden metabolizar el nitrógeno atmosférico en una forma bioprocesable.
La nitrogenasa era esencialmente la única fuente de nitrógeno fijo en la biosfera hasta la llegada del proceso Haber-Bosch, el procedimiento industrial para convertir el nitrógeno atmosférico en amoníaco, hace más de cien años. El amoníaco producido industrialmente se usa en gran medida para fertilizantes, y su advenimiento revolucionó las prácticas agrícolas en la primera mitad del siglo XX.el siglo. El proceso de Haber-Bosch se ha citado a menudo como el factor que impulsó la explosión demográfica mundial durante el siglo pasado, al haber «convertido el aire en pan».
Sin embargo, el proceso de Haber-Bosch consume mucha energía y requiere temperaturas que superan los 400 °C y altas presiones de hidrógeno gaseoso. Se estima que el 1-2% de toda la producción mundial de energía es consumida por el proceso Haber-Bosch. El proceso también genera preocupaciones ambientales, incluida la lixiviación de nitratos en las aguas subterráneas y mayores emisiones de óxido nitroso, un gas de efecto invernadero.
Una pregunta clave que impulsa la investigación sobre la fijación biológica de nitrógeno es el contraste entre la nitrogenasa y el proceso de Haber-Bosch. ¿Cómo cataliza la enzima la reducción de nitrógeno a temperatura y presión ambiente cuando el proceso industrial requiere condiciones tan extremas?
«Si podemos comprender el mecanismo de la nitrogenasa, es posible que no solo descubramos por qué la naturaleza la desarrolló para que sea una enzima tan compleja, sino que también podríamos descubrir los principios de diseño para la producción de amoníaco de una manera más rentable y respetuosa con el medio ambiente», afirmó. Tezcan.
Aunque se sabe mucho sobre la estructura de la nitrogenasa, hasta ahora nadie ha podido adquirir imágenes de resolución atómica de la enzima mientras se «gira» o se encuentra en el proceso de catalizar el nitrógeno atmosférico en amoníaco, en gran parte debido a limitaciones tecnológicas.
Aunque los científicos pueden obtener imágenes de proteínas con resolución atómica utilizando cristalografía de rayos X, este método requiere que las proteínas se fijen en su lugar dentro de un cristal, estacionario en cierto sentido, lo que significa que no puede capturar la nitrogenasa en acción. La catálisis con nitrogenasa requiere que diferentes partes de la enzima se asocien entre sí y luego se separen varias veces para formar una sola molécula de amoníaco a partir de nitrógeno. El proceso es cualquier cosa menos estacionario.
CryoEM no solo permite a los investigadores capturar las estructuras de las proteínas sin necesidad de fijarlas en cristales, sino que, gracias a los avances recientes en hardware y procesamiento de datos, lo hace con resolución atómica. Se necesita una resolución tan alta para visualizar los pequeños cambios asociados con la catálisis enzimática.
Estos avances llevaron a Tezcan y a la estudiante graduada Hannah Rutledge a considerar el uso de cryoEM para estudiar la acción catalítica de la nitrogenasa. Y para esto, buscaron la ayuda del experto residente en cryoEM, Mark Herzik, y los miembros de su grupo, Brian Cook y Hoang Nguyen.
«Este fue un proyecto emocionante y tecnológicamente desafiante para llevar a cabo, nada menos que durante la pandemia. Aunque cryoEM es una técnica muy capaz, pocos estudios han informado sobre enzimas mientras se someten a catálisis. Los conocimientos críticos y los desarrollos tecnológicos en este estudio no solo allanan el camino para futuras exploraciones del mecanismo de la nitrogenasa y enzimas en general», afirmó Herzik.
Herzik y Rutledge trabajaron en estrecha colaboración para preparar cientos de muestras crioEM. Debido a que la nitrogenasa es sensible al oxígeno, las muestras se prepararon en una caja de guantes anaeróbica, luego se transfirieron rápidamente y se congelaron en segundos para evitar cualquier degradación. Al final, el equipo recolectó más de 15 000 videos que capturaban más de 20 millones de moléculas individuales en diferentes etapas de catálisis.
Los equipos tardaron casi un año en clasificar varios terabytes de datos: descartaron imágenes de baja calidad, luego identificaron y clasificaron todas las partículas. Finalmente, pudieron obtener las primeras imágenes de nitrógenoasa con resolución atómica en medio de la rotación.
Las estructuras cryoEM revelaron varias características inesperadas de la nitrogenasa que no se habían observado previamente en las estructuras de rayos X. Es importante destacar que las nuevas observaciones proporcionan una nueva hipótesis mecánica para la catálisis de nitrogenasa. Tezcan y Herzik esperan colaborar durante muchos años para probar estas hipótesis y comprender en detalle el mecanismo catalítico de la nitrogenasa.
«Esto es solo el comienzo», dijo Tezcan. «Ahora tenemos una imagen de toda la enzima, no solo de una parte específica, durante la acción catalítica. Esto realmente abrirá las compuertas para una mayor investigación para comprender cómo funciona la nitrogenasa y, potencialmente, en el futuro, desarrollar procesos más eficientes para producir nitrógeno.»
Financiamiento proporcionado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones R01-GM099813, R35-GM138206 y T32-GM008326; concesión de la NASA 80NSSC18M0093; y el Programa de Becarios Searle. Los experimentos CryoEM se realizaron en las instalaciones CryoEM de UC San Diego, así como en el Centro Cryo-EM de Stanford-SLAC.
