Las células tienen una forma inteligente de transportar cargas como factores de crecimiento a través de la membrana celular y hacia el interior de la célula. Se llama endocitosis mediada por clatrina. Las moléculas de la proteína clatrina se acumulan en el interior de la membrana celular y la deforman para formar lo que parece un hoyo visto desde el exterior.
Después de que se llena de carga, el hoyo se pellizca para formar una vesícula unida a una membrana recubierta de clatrina dentro de la célula, que luego procede a su destino adecuado. En células cultivadas, se pueden formar cientos de estas vesículas recubiertas de clatrina cada minuto.
Sin embargo, existen modelos contradictorios sobre cómo se ensamblan estas vesículas, y esto ha dejado un vacío de conocimiento crítico. Un modelo es el modelo de curvatura constante, donde la curvatura se induce simultáneamente con la polimerización de clatrina. Otro, el modelo de transición de plano a curvo, dice que una red plana de moléculas de clatrina se ensambla primero en el interior de la membrana celular, seguido de un cambio conformacional para formar la fosa y la vesícula recubiertas de clatrina.
La evidencia de ambos modelos se puede ver mediante microscopía electrónica, pero esas son instantáneas estáticas de células fijas que no revelan la dinámica real a escala nanométrica y las posibles vías de endocitosis mediada por clatrina.
Ahora, Alexa Mattheyses y sus colegas de la Universidad de Alabama en Birmingham y la Universidad de Emory están llenando ese vacío de conocimiento, utilizando una sofisticada imagen de microscopía de fluorescencia llamada microscopía STAR. Esto les permitió seguir la formación de vesículas recubiertas de clatrina en células vivas desde el inicio hasta el final, durante períodos de hasta 100 segundos.
Su estudio, publicado en la revista Comunicaciones de la naturalezarespalda lo que se ha denominado el modelo flexible de formación de vesículas recubiertas de clatrina, que incluye las vías de transición de curva constante y de plana a curva.
«Mostramos que la acumulación de clatrina es preferentemente simultánea con la formación de curvatura en vesículas recubiertas de clatrina de vida más corta, pero favorece una transición plana a curva en vesículas recubiertas de clatrina de vida más larga», dijo Mattheyses, profesor asociado en el Departamento de Ciencias de la UAB. Biología Celular, del Desarrollo e Integrativa. «Juntos, nuestros resultados proporcionan evidencia experimental a favor del modelo flexible de endocitosis, donde un solo modelo de formación de curvatura no puede abarcar la heterogeneidad de la dinámica de la endocitosis mediada por células».
La microscopía de relación axial simultánea de dos longitudes de onda, o STAR, se basa en la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total, o TIRF, que permite la visualización de proteínas marcadas con fluorescencia en la membrana plasmática o cerca de ella, a una distancia de aproximadamente 100 a 200 nanómetros. En la microscopía STAR, la proteína se marca con dos fluoróforos que tienen diferentes longitudes de onda de excitación para aprovechar la profundidad de penetración dependiente de la longitud de onda del campo evanescente. El resultado es una capacidad para resolver simultáneamente tanto la acumulación de proteínas, medida por la intensidad de la fluorescencia, como la distancia desde la membrana plasmática, medida por la relación intensidad-fluorescencia de los dos fluoróforos. Esa distancia, que representa la distribución z de nanómetros, es una medida de curvatura en el estudio actual.
Usando células de fibroblastos de riñón de mono, Mattheyses y sus colegas etiquetaron la cadena ligera de clatrina CLCa con fluoróforos que tienen longitudes de onda de excitación de 488 y 647 nanómetros. Luego estimularon las células con factor de crecimiento epidérmico para inducir la endocitosis. El análisis cuantitativo utilizando la supercomputadora UAB Cheaha dio como resultado 1.948 acumulaciones CLCa-STAR de 13 células.
Encontraron evidencia de tres modelos de iniciación de la curvatura: nucleación, donde la formación de la curvatura comenzó menos de un segundo antes de la aparición de la clatrina; curvatura constante, donde la formación de la curvatura comenzó de uno a cuatro segundos después de la llegada de la clatrina; y transición de plano a curvo, donde la curvatura comenzó más de cuatro segundos después de la acumulación de clatrina.
Para analizar más los datos, los investigadores agruparon los eventos endocíticos en función de la vida útil de la clatrina y los modelos de formación de vesículas. Esto reveló características interesantes.
«Descubrimos que los eventos endocíticos de corta duración, menos de 20 segundos, se formaron predominantemente a través del modelo de curvatura constante, mientras que los eventos más largos (más de 20 segundos) favorecieron la transición de plano a curvo», dijo Mattheyses. «La proporción de eventos de nucleación fue menor y favoreció eventos de corta duración».
Para probar si este modelo flexible de endocitosis mediada por clatrina puede ser universal entre diferentes líneas celulares, los investigadores también tomaron imágenes de células endoteliales de la vena umbilical humana, estimuladas por el factor de crecimiento del endotelio vascular para estimular la endocitosis. Encontraron una gama similar de eventos endocíticos.
«Estos datos muestran la heterogeneidad previamente no apreciada de la dinámica de endocitosis mediada por clatrina y la plasticidad de la formación de vesículas recubiertas de clatrina, y sugieren que diferentes tipos de células o cargas pueden usar esta flexibilidad para afectar el modo de formación de la curvatura», dijo Mattheyses. «La investigación futura con microscopía STAR definirá cómo el reclutamiento de proteínas accesorias y el papel de los parámetros biofísicos contribuyen a la formación de vesículas y cómo las diferentes dinámicas de clatrina impactan en la señalización y la homeostasis celular».
Los coautores del estudio, «La dinámica de formación de vesículas por imágenes respalda el modelo flexible de endocitosis mediada por clatrina», son Tomasz J. Nawara, Yancey D. Williams II, Tejeshwar C. Rao y Elizabeth Sztul, del Departamento de Células, Desarrollo y Desarrollo de la UAB. Biología Integrativa; y Yuesong Hu y Khalid Salaita, Departamento de Química de la Universidad de Emory, Atlanta, Georgia.
Mattheyses y Salaita desarrollaron juntos la microscopía STAR en Emory en 2015. Mattheyses ha estado trabajando con la microscopía TIRF desde su Ph.D. trabajo en la Universidad de Michigan con Daniel Axelrod, Ph.D., considerado por muchos un pionero de la técnica.
El apoyo provino de la subvención GM3099 de los Institutos Nacionales de Salud, la subvención CAREER 83200 de la Fundación Nacional de Ciencias y la subvención 906086 de la Asociación Americana del Corazón.
Biología Celular, del Desarrollo e Integrativa es un departamento de la Facultad de Medicina Marnix E. Heersink de la UAB.
